流式样本单细胞悬液的制备方法的介绍

想要流式的染色结果好，必须用单细胞悬液，细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。从固态组织样本中制备单细胞悬液需要借助机械分离和（或者）酶消化。操作条件和酶的选择等需要根据经验进行一定的调整。以下是将四种常见的流式样本制备成单细胞悬液的方法
 
一：组织培养细胞
? 所需试剂器皿：
1、 Accutase酶 (eBioscience Cat#00-4555)
2、 流式染色缓冲液（eBioscience Cat#00-4222）
3、 15或50ml离心管
? 实验步骤：
1、 对于悬浮生长的细胞，将细胞转移至离心管中，进行计数和活力分析后进入第3步；
2、 对于贴壁生长的细胞系，我们推荐用Accutase酶将细胞从培养皿中消化下来并分离聚集细胞。将细胞转移至离心管中进行计数和活力分析后进入第3步（注意：Accutase酶会改变某些细胞的表面抗原表位）；
3、 离心后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
 
二、淋巴组织细胞
一般来说机械分离淋巴组织足够将细胞释放为单细胞悬液。
? 所需试剂器皿：
1、60mm×15mm的组织培养皿
2、3ml注射器
3、细胞过滤器（尼龙滤网）
4、流式染色缓冲液（eBioscience Cat#00-4222）
5、15或50ml离心管
? 实验步骤：
1、 将获得的组织（脾脏、淋巴结、胸腺）放入到组织培养皿中，用3ml注射器活塞加压的方法把组织分散为单细胞悬液（或者可以在10ml流式染色缓冲液总用两片载玻片把组织压成糊状）；
2、 用10ml流式染色缓冲液收集细胞，并将细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片。将悬液收集到离心管中；
3、 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
4、 重悬沉淀细胞并做计数和活力分析；
5、 重复步骤3后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
 
三、非淋巴组织细胞
? 所需试剂器皿：
1、 剪刀或手术刀片
2、 PBS或其他合适的生理缓冲液
3、 60mm×15mm的组织培养皿
4、 3ml注射器
5、 细胞过滤器（尼龙滤网）
6、 流式染色缓冲液（eBioscience Cat#00-4222）
7、 15或50ml离心管
? 实验步骤：
1、 将组织用剪刀或手术刀片弄成2-4mm大小的碎块；
2、 加入用PBS稀释的适量的酶，最合适孵育的时间和温度参考所用酶的操作说明书（注意：酶的种类取决于组织的类型；
3、 用移液枪轻轻吹打分散细胞后，用过滤器过滤除去细胞团和碎片，收集细胞悬液至离心管中；
4、 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
5、 用PBS重悬细胞，去除多余的酶溶液；
6、 按步骤4的方法离心；
7、 重复步骤5和6；
8、 用流式染色缓冲液重悬细胞，并进行计数和活力分析；
9、 按步骤4的方法离心，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
 
四、从全血中分离PBMC
? 所需试剂器皿：
1、 PBS
2、 Ficoll或者其他密度梯度分离液
3、 流式染色缓冲液（eBioscience Cat#00-4222）
4、 15或50ml离心管
? 实验步骤：
1、 将全血用PBS 1:1在锥形管中稀释；
2、 在稀释的样本上面加入等体积的Ficoll；
3、 1000g离心20min;
4、 将位于PBS和Ficoll层间的PBMC转移到一个新的管中；
5、 加入PBS清洗细胞；
6、 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
7、 用流式染色缓冲液重悬沉淀细胞并做计数和活力分析；
8、 重复步骤6后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。

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