牛乳腺上皮细胞的分离纯化培养及鉴定

剪取新鲜的牛乳腺组织切除脂肪及结缔组织并用灭菌 PBS 洗涤，剪切并吹打分散培养，胰酶消化除去成纤维细胞，继续培养。用免疫荧光染色法鉴定纯化后的乳腺细胞中角蛋白 18 的表达。将纯化的乳腺上皮细胞加入有盖玻片的培养板中培养，以 4%多聚甲醛固定 10 min，洗涤 3 次。封闭 30 min，PBS 洗涤 3 次。加入 1﹕100 兔抗角蛋白 18 抗体，37 °C 孵育 1 h，洗涤 3 次。1∶100 FITC-山羊抗兔 IgG 抗体，37 °C 作用 1 h，洗涤 3 次，荧光显微镜观察。
细菌的培养
将 SA 菌株 GY278、GY309 接种于鲜血培养基 37 °C 过夜培养。挑取单菌落接种于液体培养基中培养 5 h，收集菌体用 DMEM 重悬并调节菌体浓度为 1×108 CFU/mL。
抗体对黏附的抑制
待乳腺上皮细胞生长汇集达到 80%时，PBS 洗涤 3 次，0.2% Triton X-100 作用 5 min。以 MOI=100∶1 比例用 SA 与细胞作用 2 h，对照组用 DMEM 培养液处理。PBS 洗涤 3 次，胰蛋白酶消化，终止消化后 1∶10000 稀释，取 100 μL 细胞液涂板(3 个重复)，37 °C 培养进行菌落计数。将 50 μL ClfA、FnBPA 及 EfB 特异血清(1∶5 稀释)与 SA (5×108 CFU/mL) 37 °C 作用 1 h。将与抗体作用后的细菌按 MOI=100∶1 加到乳腺上皮细胞中，37 °C 作用 1 h。PBS 洗涤 5 次。胰酶消化使细胞分散。将细胞进行 1∶10000 稀释，取 100 μL 细胞液涂板(3 个重复)，37 °C 培养进行菌落计数。
荧光染色法观察黏附及黏附抑制
将培养的 SA 用 PBS 洗涤 3 次；用含 1∶1000 CFSE 染料染色 10 min。细胞生长汇集达 80%，PBS 洗涤 2 次；用 DiI 染色 10 min；PBS 洗涤 3 次。将染色后的 SA 与乳腺上皮细胞 37 °C、5% CO2 条件下作用 2 h，洗涤 5 次，封片后用荧光显微镜观察黏附。将染色后的 SA 与等体积的含黏附素分子免疫血清(1∶5 稀释) 37 °C 作用 30 min (3 个重复)，将与抗体作用后的细菌按 MOI=100∶1 加到染色后的乳腺上皮细胞中作用 2 h，PBS 洗涤 3 次，封片后荧光显微镜观察。

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