TaqMan探针的实验验证：检测体系中的功能性确认

即使生物信息学预测良好，仍需通过实验验证探针在真实反应体系中的行为。

熔解曲线分析（适用于染料法对照或探针法辅助验证）

虽然TaqMan探针法本身不依赖熔解曲线判断产物纯度，但在方法开发初期，可先使用SYBR Green I染料法配合相同引物进行扩增，观察熔解曲线是否呈现单一尖锐峰。

单一峰提示扩增产物均一，间接支持引物-探针系统的特异性。

‌扩增曲线与Ct值分析‌

特异性良好的探针应产生清晰、光滑的“S”型扩增曲线，且不同浓度样本间Ct值差异合理。

出现非典型曲线（如平台期荧光上升缓慢、基线漂移）可能提示非特异性信号积累。

‌电泳验证（辅助手段）‌

可将qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认条带大小是否与预期一致，且无杂带或引物二聚体。

注意：此方法为终点检测，不能反映实时荧光信号来源，仅作补充。

‌阴性对照检测‌

在无模板对照（NTC）中应无扩增信号（Ct值未检出或远高于阳性样本）。

若NTC出现扩增，提示探针或引物发生非特异性结合或污染，需优化反应条件或重新设计。

‌跨样本特异性测试‌

使用含有潜在干扰序列的样本（如同源基因高表达样本、相关病原体混合样本）进行检测，确认探针仅对目标序列响应。

例如，在检测某种病毒变异株时，验证其不识别野生型或其他亚型。

动态范围验证

 通过梯度稀释模板（建议5-6个数量级）建立标准曲线，理想条件下R²应＞0.99，扩增效率90%-110%。若效率偏离此范围，需检查探针浓度是否饱和（典型表现为高浓度样本曲线平台期提前）或存在抑制物（低浓度样本Ct值异常后移）。建议采用双重复实验，观察批内与批间差异。

竞争性抑制实验

 针对多靶点检测体系，可设计竞争性模板：在反应体系中加入等量干扰序列（如SNP位点突变体），目标序列Ct值偏移应＜1.5个循环。该方法特别适用于区分高度同源序列，例如新冠病毒Delta与Omicron变异株的特异性探针验证。

冻融稳定性测试 

将探针工作液经历3次-20℃/室温冻融循环后，对比新鲜配制试剂的扩增效率差异。优质探针应保持Ct值变异系数（CV）＜5%，若出现信号衰减，建议分装保存或改用甘油稳定剂体系。

‍临床应用预验证 

在进入临床样本检测前，需进行以下关键测试： 1. 基质效应评估：使用不同来源样本（如血清/鼻咽拭子/痰液）提取的核酸进行检测，观察Ct值波动情况； 2. 抗干扰测试：加入常见内源性物质（血红蛋白≤10mg/ml、免疫球蛋白≤5mg/ml）验证信号稳定性； 3. 极限检测验证：用国际标准品确定检测下限（LoD），建议采用95%阳性检出率对应的浓度值。

（实验设计要点：建议采用"阶梯式验证"策略，先完成基础性能确认后再开展复杂样本测试。所有数据应记录原始荧光轨迹图，便于追溯异常曲线。对于诊断用途探针，必须通过至少3家独立实验室的比对验证。）