茹拉巴德古柏线虫探针法荧光定量PCR试剂盒反应流程常规程序:

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

3．反应时间

变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

4．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

5．PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如AmpliWaxPCRQam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
小鼠载脂蛋白E(mouse APO E)
小鼠B淋巴细胞刺激因子(mouse BAFF)
小鼠凋亡因子BAX(mouse BAX)
小鼠细胞凋亡相关基因(mouse BCL-2)
小鼠脑衍化神经营养因子(mouse BDNF)
小鼠脑衍化神经营养因子受体(mouse BDNF R)
小鼠骨成型蛋白-2(mouse BMP-2)
小鼠骨成型蛋白-4(mouse BMP-4)
小鼠骨成型蛋白受体1A(mouse BMP-R1A)
小鼠骨成型蛋白受体Ⅱ(mouse BMP-R2)
小鼠脑钠肽(mouse BNP)
小鼠N端前脑钠素(mouse NT-proBNP)
小鼠骨唾液酸蛋白(mouse BSP)
小鼠CXCL3(mouse CXCL-3)
小鼠CXCR4(mouse CXCR-4)
小鼠皮质酮(mouse Corticosterone)
小鼠环氧化酶-2 (mouse COX-2)
小鼠结缔组织生长因子(mouse CTGF)
小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (mouse CTLA-4)
小鼠细胞色素P450(mouse Cytochrome P450)
小鼠C反应蛋白(mouse CRP)
小鼠CXC趋化因子受体3(mouse CXCR3)
小鼠CXC趋化因子配体16(mouse CXCL16)
小鼠CXCL1/KC(mouse KC)
小鼠环磷酸腺苷(mouse cAMP)
小鼠环磷酸鸟苷(mouse cGMP)