酸性木聚糖酶-酸性半纤维素酶可见分光光度法检测试剂盒操作步骤

酸性木聚糖酶-酸性半纤维素酶可见分光光度法检测试剂盒操作步骤：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4 ℃或冰浴预冷的PBS 或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用预冷组织细胞裂解液4 ℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。
b. 组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9% NaCl ，含有0.16mg/ml肝素钠) 灌流血液后获取组织样品。按照每100mg加入500-1000ul组织细胞裂解液比例， 4 ℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4 ℃离心，取上清作为待测样品。
d. 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（P1511）测定蛋白浓度。通常10-20ug蛋白的细胞或组织匀浆液样品中SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考) 。每种样品准备20-100 ug蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏通常需要稀释10-100 倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-70 ℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
        
2. 试剂盒的准备工作：
a. WST-8酶工作液的配制： 参照下表，根据待检测样品(包括标准品) 数量，配制适量WST-8酶工作液，配制好的WST-8酶工作液4 ℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用。
注意：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
b. 反应启动工作液配制：将试剂盒提供的反应启动液 (40X) 溶解后混匀，按1μl 反应启动液(40X) 加入39μl SOD 检测缓冲液的比例进行稀释，即为反应启动工作液。4℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用。
c. (可选做) SOD 标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：20U/ml，10U/ml ，5U/ml，2.5U/ml，1.25U/ml，0.625U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：为避免稀释后SOD酶活性的下降， SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。
3. 样品测定：
a. 参考下表使用96孔板加入各个组分，注意设置样品孔和各种空白对照孔。
注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。
b. 37℃孵育30分钟。
说明：孵育25至35分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为检测结果的一致性，推荐孵育30分钟。
c. 450nm 测定吸光度。如无450nm 滤光片，可以使用420-480nm 的滤光片。也可以使用大于600nm 的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD活力的计算：
a. 百分率的计算：
参考如下计算公式计算百分率：
百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%
如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：
百分率＝(A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%
如果计算出来的百分率小于30% 或大于70% ，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的百分率在30-70%范围内。如果测定出来的百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的百分率偏低，则需重新准备浓度较高的待测样品。
b. SOD酶活力单位的定义：在上述化酶藕联反应体系中百分率为50% 时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位 (unit)。注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换算。

phospho-AMPK beta 1     磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶β1抗体
phospho-ALK     磷酸化间变型淋巴瘤激酶抗体
phospho-ATM    磷酸化毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白抗体
phospho-ATP citrate lyase     磷酸化三磷酸腺柠檬酸裂解酶抗体
phospho-ATR     磷酸化ATR抗体
AMN1    细胞核重定位及纺锤体检查点蛋白AMN1抗体
ALG11    天门冬酰胺连接糖基化11抗体
ASF1A    细胞衰老相关蛋白ASF1A抗体
AGPHD1    氨基糖苷类磷酸结构域蛋白抗体
ASGPR1    唾液酸糖蛋白受体1抗体
ARSF    芳香基硫酸酯酶F抗体
AKAP5    A激酶锚定蛋白5抗体
ATXN3L    小脑脊髓共济失调蛋白3抗体
ASTE1    ASTE1蛋白抗体
phospho-APG4B    磷酸化自噬相关蛋白4B抗体
AFAP    微丝相关蛋白1抗体
ADORA1    腺苷A1A受体抗体
ARSB    芳基硫酸酯酶B抗体
A2BP1    共济失调蛋白2结合蛋白1抗体
ADAM17    肿瘤坏死因子α转换酶
ARNT2     芳香烃受体核转录蛋白2抗体
ABH8    AlkB同源蛋白8抗体
ABI3BP    ABI基因家族成员3结合蛋白抗体