海鸥弯曲杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒使用方法

 海鸥弯曲杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒使用方法：

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
           
二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）
赖氨酸酮戊二酸还原酶抗体
锚蛋白重复域6抗体
精氨酸酶2抗体
醛固酮还原酶家族1成员C3抗体
促肾上腺皮质激素受体
褐黑素相关蛋白ART抗体
肾上腺皮质线粒体铁氧还蛋白抗体
Allgrove综合征相关蛋白抗体
腺相关病毒5 VP1抗体
脂肪醛脱氢酶抗体
抗利尿激素1A抗体
抗利尿激素受体1B抗体
二磷酸腺苷核糖基化因子鸟嘌呤核苷酸交换因子2抗体
α增强子结合蛋白1抗体
脊髓小脑共济失调10抗体
蛋白激酶A锚定蛋白7抗体
腺苷三磷酸结合盒转运体12抗体
腺苷三磷酸结合盒转运体9抗体
三磷酸腺苷结合盒转运蛋白4抗体
肌动蛋白结合蛋白LIM3抗体
高尔基复合体相关蛋白1抗体
乙酰辅酶A羧化酶1ACCα抗体
腺嘌呤核苷酸转运蛋白1、2、3、4抗体
去整合素样金属蛋白酶12
磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1ACCα抗体