胚胎成纤维细胞传代步骤：
如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.去培养上清,用不含钙、镁高子的PBS润洗细胞1-2次。
2カ2mi化液(0.25% Trypsin-0.53 MM EDTA)于培养飛中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然言在売微境下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下高心4分钟,弃去上请液,补加1-2mL培并液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8m培养基的新皿中或者瓶中。细胞复苏步張:将含有1mL胞液的冻存管在37て水浴中迅速鬼解冻,加入4mL培养基混合均匀。在
条件下离心4分钟清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8m培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞空度。细胞六存步待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为例;1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗丽底1-2次后加入1ml酶,细胞变园脱落后,加入2m完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。2.1000RPM高心5分钟去揮上清。用血清重暴浮,加DMSO至最終浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存普细数目大于1X106个细胞六存3.将东存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮情存。记录六存管位置以便下次拿取。
运辅和保存视天气状泥和运距高远近,公司与客户协商后远择下述方式中的一种进行
1)1mL冻存细液装于1.ml的冻存管中,置了続满干水的泡沫保温盒中进行运;收到胞后青尽快解六复苏细胞进行培养,如无法立刻进行复苏提作,冻存细胞可在80℃的条件下保存1个月。
2)T-25培瓶充满完全培养基后进行第温运;收到细胞后请镜下观察细胞生长状态,如铺瓶本超过85%青立印进行传代提作,如慧浮的细胞较多,请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴。