重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒操作步骤

重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒操作步骤

①将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔（复孔），每孔 100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于 37℃孵育 60 分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。

加样时间控制在10分钟内。

②洗涤：甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL（根据加满孔的标准进行调整）洗涤液，浸泡 2-3 分钟，甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。重复此洗板步骤3次。

③每孔加入 HRP-抗体工作液 100 μL，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡，将酶标板覆膜并置于 37℃孵育 30 分钟。

④洗涤：用洗涤液洗板 4 次，方法同步骤 2。

提示：酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差，或背景值高。应注意加入洗涤液的体积，以加满酶标板的孔为标准进行调整，确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡 2-3 分钟。

⑤显色：每孔加显色底物（TMB）工作液 100 μL，酶标板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分钟。提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽，但应严格避免底物污染，确保所使用的加样槽洁净或一次性使用，加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。可通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在 5-30 分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

⑥终止：每孔加终止液 50 μL，终止反应，室温放置 1 分钟。推荐使用排枪和加样槽。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。

⑦读数：用酶标仪在 450 nm 波长（参考波长 650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm 值）。

提示: 请提前 15 分钟打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。