稳转细胞系的构建

      一般来讲 shRNA 用的是 HIV 病毒，虽然已经经过处理，但是一听这名字也觉得渗人，无论如何保护自己是在实验室永葆青春的基础，所以一定要保护好自己，需要生物安全柜（往里吹风zui好），或者超净台（把风给关了 （*^__^*））。

     病毒来了，需要分装，-80 保存，反复冻融影响病毒活性，一般情况系，我是将病毒分成 10 ul 一管。其次是看清你自己的病毒情况，是荧光标记（一般 GFP），还是非荧光标记 （一般标签蛋白是过表达是 Flag，敲降是 scramble）。
 
     元元做的是肿瘤相关实验，所以咱们这里讲的是贴壁的肿瘤细胞的稳转，一定注意，元元讲的是普适的方法，一定要看厂家的说明书。一般先用带有 GFP 荧光的病毒摸一下合适的病毒量。先做一下预实验，（别人都讲 MOI 值，即感染时病毒与细胞数量的比值），元元不讲。

1. 慢病毒转染前 18～24 小时，将贴壁细胞 以 1×10^5（根据细胞大小而定，一般转染前细胞长到 40-60% 为宜）孔铺到 24 孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为 2×10^5/孔左右。

2. 加入 polybrene6-8 ug/ml（这个相当是破膜剂，只有细胞膜破了，病毒才有机会进入细胞内发挥作用），设置合适的病毒浓度梯度，比如 24 孔板，设置 5 个梯度，分别加入病毒量是 0，1，2，3，4，5 ul，37 ℃ 孵育。这时候用的是无血清的培养基培养。

3. 4～6 h 换液 （正常的含血清的新鲜培养基），继续培养，如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染 48 小时后可见明显荧光表达，72 小时后更加明显。用荧光显微镜观察细胞的转染效率，一般病毒量达到一定程度之后就荧光强度就不再增加了。

4. 选择一个合适的病毒量就可以做实验了，如果 3ul 的时候病毒的转染效率已经和后面的没有区别了，在 24 孔板里，合适的病毒量就是 3ul。这时候就可以构建的稳转细胞系了。

5. 当你把实验组对照组转完病毒后 24 h 就可以进行嘌呤筛选，因为病毒转完之后转染效率不可能达到 100%，而慢病毒在构建的时候就含有嘌呤抗性基因，一旦转入细胞，嘌呤抗性基因就能表达嘌呤抗性蛋白，可以抵抗嘌呤对细胞的杀伤作用。